生长学是临床诊断未知病因矮身高儿童shox单倍体不足的重要方法
摘要：在某些特发性矮身高和许多莱里-韦尔（leri-weill）软骨骨生成障碍病人，shox（short stature homeobox-containing gene）突变引起单倍体不足（haploinsufficiency）。约80%的shox 突变为基因完全缺失，其余的为各种点突变。本文目的为估价特发性矮身高儿童shox突变的发生率，提出单倍体不足的表型特征。我们募集了140名特发性矮身高儿童（61女）。特发性矮身高的定义为，有正常igf-i和自由睾酮、女性有正常的核型，无肌内膜抗体、长期器质性、心理性或综合症疾病，并且无明显的骨发育异常征兆。测量记录身高、臂展、坐高，计算坐骨下腿长。以荧光引物pcr扩增shox编码区域附近两个高度多态性微卫星标记(ca-shox 重复和dxys233)，并以自动测序仪分离。对每一标记仅有1个片段大小的渊源者分析父母的dna。在三个渊源者（2%）证实了由shox缺失引起的shox单倍体不足，三名病人都为女性，携带有父亲等位基因的全部缺失。与其它137名检测的儿童相比，臂、腿显著缩短而有低-正常的坐高。因此，3名shox单倍体不足渊源者的肢体/躯干比例（腿长与臂展之和除以坐高）显著低于全组病人。这个观察结果得到另外5名以前诊断为shox单倍体不足病人（4女）生长学数据的证实，除了一名年龄最小的女孩外，以身高调整的肢体/躯干比例低于平均数1sd以上。所有shox单倍体不足的儿童至少表现出一种莱里-韦尔软骨骨生成障碍的x线表现特征——远侧桡骨骺三角形化、远侧排腕骨的锥体化、桡骨远侧尺骨端透明。我们的观察提示，可以肢体/躯干比例低于1.95 1/2身高（m）和手腕x线片的重要判断筛选shox突变的儿童。
(j clin endocrinol metab 88: 4891–4896, 2003)
在某些特发性矮身高（idiopathic short stature，iss）和许多leri-weill软骨骨生成障碍（leri-weill-dyschondrosteosis，lwd)病人，已经报告了引起单倍体不足的拟常染色体shox（矮身高同源框基因）杂合性突变。leri-weill软骨骨生成障碍是一种骨软骨发育不良症，有肢中性矮身高和腕部马德隆畸形表现。由妊娠第二个月，shox开始在人类胚胎成骨细胞中表达。选择性剪接生成两种蛋白，其中非截短的shoxa引起体外基因转录。在骨的个体发生、骨代谢和生长的调节中，它的确切作用尚不了解。约80%的shox突变为完全基因缺失，其余为点突变。除了不成比例的矮身高外，lwd病人的常见征兆为肘外翻，高腭穹和脊柱侧凸，与在染色体畸变基础上有shox缺失的特纳综合征女性的部分表型相类似。甚至在同一家庭，shox单倍体不足的表型高度可变，说明了较差的基因型-表型关系。最初，在一名特发性矮身高儿童发现shox突变提出了两个问题：1）迄今有多少未知病因（特发性）的矮身高儿童有shox单倍体不足？2）在临床上能够识别表型吗？最近，rappold et al.报告了特发性矮身高儿童shox缺陷的发生率，但研究中未排除父母有马德隆畸形的个体，也无生长学和放射学确切数据。与此相反，其它两个研究组未发现特发性矮身高儿童的shox缺陷，而是在矮身高和lwd的几名渊源者发现有shox缺陷。
在本文中，我们报告了140名具有特发性矮身高特征的儿童所进行的shox缺失筛查结果。在此基础上，我们提出特发性矮身高学龄儿童生长学判断方法，在骨骼生长不成比例个体中确定shox分子学分析的候选者。而且也讨论了特定x线表现的作用。
受试者和方法
个体
为了shox缺失筛查，由我们生长研究中心3名有经验的儿科内分泌医师募集了140名（61女）特发性矮身高儿童。年龄范围在2.6~16.1岁（中位数9.1岁）。特发性矮身高定义为：igf-i和自由t4正常，女性核型正常，无肌内膜抗体，无长期器质性、心理性或畸形疾病，无明显骨发育不良征兆（包括马德隆畸形）。这些标准依据于特发性矮身高定义共识。记录身高、臂展和坐高，计算坐骨下腿长。经证实为shox的渊源者要在我们诊所再次检测，并再次拍摄左手腕x线片。也再次分析了10名肢体最短、无shox缺失的渊源者。此外，再次回顾性分析我们诊所以前检测出的shox单倍体不足儿童（n=5）的生长学和放射学数据。
所有sd分值依据荷兰标准计算。有所有儿童和/父母得到知情同意书。
方法
由血液淋巴细胞提取基因组dna。使用荧光引物pcr扩增位于xp22.3前后和shox基因座的两个高度多态性微卫星，并以自动测序仪器分离。以shox末端定位ca-shox重复，dxys233周围300–350 kb位于shox近侧。如果二者端粒标记(dxys233, ca-shox 重复)之一仅有1个片段大小，则进行父母dna分析。这种分析能够使我们区分纯合子（相同大小的两等位基因）与半合子（缺失一个等位基因）。
统计学分析
在所有生长学参数正态分布的基础上，当3名shox缺失儿童的数值在无shox缺失儿童组95%置信区间之外时，为有统计学显著性差异。使用jmo 4.0.5版软件进行统计分析。
结果
通过位于shox基因座和2个微卫星标记的扩增，在11名渊源者（7%）发现2标记仅有单一片段，提示了半合子或纯合子shox基因座。在11名渊源者中，仅8名有父母dna，但有2名是不提供信息的。通过父母等位基因扩增，在3名女孩（2%）证实了shox缺失的半合子（图1）。通过以前报告的3个常染色体标记的扩增证明为父系。不提供信息的以及缺少父母dna的5名渊源者未排除shox缺失。
3名受累渊源者的生长学特征为短坐骨下腿长、短臂展但有低-正常的坐高（相对于年龄）。为进一步分析这一结果，我们将其与其它shox缺失阴性的137名渊源者的生长学数据进行了比较（表1和图2a-c）。3名受累渊源者的靶身高和体重（年龄的sds）在未受累组的95%的置信区间之内，但shox缺失女孩的骨骼比例与无shox缺失渊源者显著不同。证实了骨不成比例是一个特殊的表现（表1）。当依身高绘制臂展、腿长和坐高图时（图2a-c），这种表现也同样明显。
为了将骨不成比例的相关数据整合为一项，我们确定了一项生长学比值，将肢体与躯干长度相比较（下面称为及肢体/躯干比）。肢体/躯干比的定义为，（坐骨下腿长 臂展）/坐高。因此，有高肢体/躯干比为不成比例短肢体的矮身高儿童。图3为所有渊源者依身高的肢体/躯干比。该图示强调了在所有研究的特发性矮身高儿童中，3名shox缺失渊源者的骨不成比例（实心圆）的高度特殊性表现。肢体/躯干比例直线随年龄和身高而增加，反应了儿童期，臂和腿生理性生长的速度高于躯干。
因此，我们的数据提示，在特发性矮身高儿童亚组筛查shox突变是最合理的，即筛查那些有低肢体/躯干比例表现的特发性矮身高儿童。如果筛查上限定义为肢体/躯干比例低于身高调整的平均数下1sds，那么这样的生长学标准可使约84%的矮身高儿童免于遗传学筛查检测。近似计算为小于1.95 1/2身高(m)，即图3中的点线。为了检验这样一种筛查方法的敏感性，我们搜集了所有突变筛查中被排除的shox单倍体不足儿童的数据（n=5,4女），被排除的病人为有明显马德隆畸形（4号病人），rao et al.报告的已知shox无义突变（5和6号病人），以及含有shox基因座的xp末端着丝粒缺失（7和8号病人），表2。所有shox单倍体不足学龄儿童的肢体/躯干比例都低于这一限度，说明在这一组shox单倍体不足学龄儿童，筛查方法有高度敏感性（100%），图3。但是，骨不成比例的程度不同，该组中有一名年龄最小、身高最矮的儿童（5号病人）有较低而正常的肢体/躯干比例（身高2510px下2.51），但在一段时间后，下降到了低点（身高3132.5px下的2.45）。在她的受累的哥哥（6号病人），也观察到随时间的进展骨不成比例程度加大（身高2927.5px时为2.50，在身高3615px时为2.48）。
因此，根据我们的数据，在检测shox单倍体不足学龄儿童时，上述定义的肢体/躯干低于1.95 1/2身高(m)有100%的敏感性和85%的特异性。如果矮身高儿童shox单倍体不足发生率为2%，那么肢体/躯干比例小于1.95 1/2身高(m)矮身高学龄儿童有shox单倍体不足的可能性为12%（检测的阳性预测值）。更有趣的是，在身高110cm以上，肢体/躯干比例在1.95 1/2身高(m)之上的矮身高学龄儿童100%的没有shox单倍体不足（阴性预测值）。但是（如5号病人），学龄前儿童以及矮于110cm的儿童，这个检验有较低的敏感性和特异性，要小心应用。
最后，本研究中的三名shox缺失渊源者以及其它以前检出shox单倍体不足的5名病人常规左手腕x线片异常，表现出lwd的特征：远侧桡骨三角形化（88%），远侧排腕骨椎体化（88%）和桡骨的远侧尺骨侧透x光。因为我们的遗传学方法未能检测所有可能的shox缺失和shox点突变，所以我们在无shox缺失渊源者组也分析了10名有最低肢体/躯干比例病人的手腕x线片。有趣的是，10名病人中有1名女性有轻微马德隆畸形表现，可能是由于未检测出的点突变，或是其它未知基因突变引起lwd。此外，10名病人中，2名儿童（3.8岁和5.5岁）属于shox标记仅有单一片段大小的5名病人组，他们的父母dna不可提供信息或是没有样本。
讨论
shox是影响生长的重要基因，它的发现提出了一个问题，该基因多大程度的突变贡献于以前所诊断的特发性的矮身高。与特发性宽大的定义不同，最近的一个专家会议详细定义了特发性矮身高，并由定义中排除了异常身体比例的儿童。定义的理论根据将宽大范围的骨软骨发育不良排除在特发性矮身高术语之外。但是，不要忘记，对矮身高所进行的生长学评价并不全面，常常为临床观察所代替，可能忽视轻微的骨不成比例。
本文结果与以前的未知病因特发性矮身高儿童常见shox突变的研究相一致，估价的发生率至少1-2%。考虑到有一定百分数的shox突变个体并非矮身高，shox突变的检测尚不完全，总人群中shox突变发生率至少为1：4000似乎是可靠的估计。因此， 很可能shox突变比成纤维细胞生长因子受体（fgfr）3突变更为多见，估计软骨发育不全的发生率在1：15000和1：40000之间，然而，fgfr3突变引起的软骨发育不良和某些罕见的骨发育不全的发生率还不清楚。
因shox单倍不足有高发生率，所以确定及早诊断矮身高儿童的标准是重要的，特别是在证明了重组gh能有效促进生长的情况下。通过搜集所研究儿童所有的生长学数据，我们观察到，与阴性筛查结果相比，所有shox单倍体不足学龄儿童有明确的不成比例的臂和腿的缩短。其它研究者也观察到了相似的shox单倍体不足所引起的骨不成比例，但是，因为所有的渊源者为lwd家庭成员，他们搜集的数据有偏差。通过整合3个普遍使用的生长学指标，骨不成比例可定量为一项，我们称其为肢体/躯干比例，可直接将肢体长度（坐骨下腿长 臂展）与躯干长度（坐高）相比较。我们的数据提示，在以身高调整的低肢体/躯干比例 [<1.95 1/2 height (m)] 矮身高学龄儿童中，shox突变的可能性约为12%。另一方面，正常或高的肢体/躯干比例排除了shox突变。在身高低于110cm的学龄前儿童，这个规律是不可靠的，因为shox单倍体不足引起的骨不成比例尚未充分地显现。
最近，rappold et al.报告了矮身高儿童的突变筛查，检测出6名功能性shox突变。在4名有骨骼变形资料的儿童中，3名骨不成比例。但是，未列出身体比例的生长学数据。在最早发现shox的报告中，两兄弟携带无义突变，也并入本文中的受累对照组（5，6号病人）中。在6岁和8岁时他们最初被诊断为特发性矮身高。在一段时间内，二者都出现了骨不成比例，完全符合lwd的诊断。因此，低年龄儿童的临床诊断是困难的，特别是在骨不成比例尚未出现的学龄前儿童。就像在lwd家庭中一样，所谓的特发性矮身高组中，男性较少（本研究中3名女性，无男性，参考文献2中5名女无男），但两筛查组中男性较多（56%和60%）。因此，其它研究中的女性发生率不是筛查偏差的问题，而更可能是至今未知的基础机制的结果。
除了生长学外，由常规左手x线片形态学分析可以得出二线证据。虽然仅一名对照受累病人存在马德隆畸形，但我们在所有8名shox单倍体不足儿童检查出了轻微lwd腕发育异常特征。桡骨远侧尺侧缘的透明是lwd引起腕异常的早期特殊征兆，但是仅出现于半数受累儿童之中。相比之下，在除一名年幼儿童外，所有shox单倍体不足儿童都存在桡骨三角形化和腕骨锥形化。ross et al.发现，在shox单倍体不足的lwd家庭的42名渊源者中，仅有74%的受试者有类似于马德隆畸形的腕骨放射学异常。但是，在马德隆畸形阴性的9名渊源者中，7名儿童的年龄在9岁以下。因此，他们的腕骨、桡骨骨化尚未达到能详细进行放射学评价的程度。schiller et al.报告了shox单倍体不足成年人的马德隆畸形的临床和放射学表现，强调了儿童期马德隆畸形的最初征兆，例如腕部楔形是x线唯一可检测的特征。总之，绝大部分shox单倍体不足病人可能出现马德隆畸形。儿童期放射学诊断的缺点是桡骨骺骨化尚不充分，在女孩骨龄9岁、男孩骨龄11岁才足以能够诊断。因此，如果shox突变为非完全缺失的，应当进行受累父母的放射学（临床）分析。
结论，我们的遗传学和临床分析说明，shox单倍体不足引起典型的骨不成比例和腕部异常，对绝大部分学龄儿童进行详细的生长学和放射学分析即可鉴别。应对肢体/躯干比例不足1.95 1/2 身高 (m)的矮身高学龄儿童进行shox突变筛选。如果骨成熟度达到并有放射学经验情况下，筛查目标组可以进一步缩小到有马德隆畸形放射学征兆的儿童。shox单倍体不足表型类似于所有程度的lwd，似乎比fgfr3突变引起的矮身高表型更为常见。