shox同源框基因缺失是矮身高儿童生长障碍的重要原因
gudrun a. rappold, maki fukami, beate niesler, simone schiller, walter zumkeller, markus bettendorf, udo heinrich, elpis vlachopapadoupoulou, thomas reinehr, kazumichi onigata and tsutomu ogata
institute of human genetics (g.a.r., m.f., b.n., s.s.) and department of pediatrics (m.b., u.h.), university of heidelberg, 69120 heidelberg, germany; children’s university hospital (w.z.), 06097 halle, germany; department of growth and development, university of athens (e.v.), 11527 athens, greece; vestische kinderklinik, university of witten/herdecke (t.r.), 45711 datteln, germany; department of pediatrics, gunma university school of medicine (k.o.), 371-8510 maebashi city, japan; and department of pediatrics, keio university school of medicine and tokyo electric power co. hospital (t.o.), 160-0016 tokyo, japan
摘要：矮身高的发生率在3%，是儿童常见疾病。特发性矮身高指的是不同未知病因的矮身高病人。最近证明人同源框基因-shox（矮身高同源框）与特纳综合征以及大部分léri-weill软骨骨生成障碍病人的矮身高表型有关。本文特别研究了矮身高病人shox突变的发生率和类型。我们在750名病人使用单链构象多态性，分析shox基因内突变；在150名病人使用荧光原位杂交方法，分析全基因缺失（总计900名病人）。这是目前研究shox突变的最大矮身高病人样本组。所有病人有正常的核型，生活年龄的身高低于国家身高标准3rd百分位数或-2 sds，诊断时均无明显leri-weill综合征骨骼特征。
在分析基因内突变的750名病人中，鉴别出9名病人编码shox区域有基因静止、错义、无义突变和小的缺失。在研究基因缺失的150名病人中，有3名病人完全的基因缺失。根据父母与正常对照的基因型与表型关系，9名基因内突变的病人中，至少有3名是功能性的。我们结论，在2.4%的矮身高儿童中检测出了shox突变。shox突变谱是偏斜的，大多数为完全缺失。在矮身高儿童中，由于shox基因突变矮身高的发生率似乎与gh缺乏或特纳综合征相似。shox突变儿童的家庭研究经常揭示，有相同突变的年龄较大的家庭成员表现出类似特纳综合症的轻微特征，例如高穹颚，短颈，关节发育异常，肘外翻，膝外翻，短第4掌骨和马德隆畸形。
jcem, 2002, 87(3):1402-1406.
许多矮身高儿童的病因尚不了解。因为通常存在矮身高的家庭倾向，所以推测遗传因素可解释这些儿童的矮身高。一个未解决的问题是：在当前称为特发性的病例中，未鉴别的单基因疾病在多大程度上引起生长障碍。
在过去的4年中，已经证明位于x和y染色体上拟常染色体区域内的shox（矮身高基因框）基因与特纳综合征和léri-weill软骨骨生成障碍（lwd）的矮身高有关。lwd是一种中肢性矮身高综合征，以称为马德隆畸形的前臂骨异常为特征。在这两种综合征中已经发现了shox单倍体不足。最常见的特纳综合征为x染色体丢失(45,x)，在60%以上lwd病人存在shox基因缺失或点突变。特纳综合征和lwd的骨异常有共同之处，而特纳综合征的其它特征，例如卵巢障碍，淋巴水肿，心脏和肾脏异常则不相同。
虽然已经证实特纳综合征和lwd的shox缺失，但目前对shox突变在单纯矮身高病人的作用了解甚少。rao et al.使用单链构型多态性分析(sscp)，在91名病人中发现1例shox基因外显子5无义突变，在家庭成员中与矮身高表型共分离。binder et al.应用荧光原位杂交（fish）方法，在68名病人中报告了1例的矮身高并shox基因缺失病人。
为了更全面评估矮身高病人shox突变发生率和类型，我们使用有不同突变检测范围的sscp和fish方法，分析了shox基因区域。对900名矮身高儿童的研究结果表明矮身高病人shox突变的发生率为2.4%。
受试者和方法
病人
使用下列标准募集了900名男女矮身高病人：生活年龄身高低于国家生长标准3rd百分位数或-2 sds，无已知病因（包括骨发育异常和性腺生殖障碍），食物摄取正常，核型正常。矮身高儿童来自3个不同的国家（日本，德国和希腊）。在900名病人中，日本623名，德国249名，希腊28名。因为部分医生提供了dna，而其它医生提供了中期染色体涂片，所以750名病人使用sscp筛查，150名病人使用fish筛查。750名病人中有474男，276女；150名病人中有79女，71男。两人群年龄范围相似，所有矮身高儿童均无亲属关系，经过内分泌医生诊断。在取血样时，获得所有病人的完全病史。该研究得到管理委员会批准，由病人和合法监护人取得知情同意书。使用100名正常身高、正常核型并无特定疾病个体的dna作为对照。
sscp突变分析
使用标准方法，由外周血液淋巴细胞提取dna。使用以前报告的方法进行pcr和sscp分析。对每一个体病人的dna完成8次不同的pcr扩增，覆盖全部shoxa的蛋白编码区域，以及5’-非翻译区（外显子2~6a）。
pcr产物克隆和测序
pcr产物被克隆入pcr2.1-topo载体。使用循环测序法分别进行3次每等位基因克隆的测序，并以以前报告的方法在自动测序仪上分析。
fish分析
在以前报告的条件下，以llnoyco3′m′34f5生物素标记的粘性质粒dna与病人刺激的淋巴细胞中期染色体杂交。经过抗生物素蛋白结合的异硫氰酸荧光素检测杂交的探针。
结果
在750名矮身高病人筛查shoxa编码区域的基因内突变，遍布5个外显子（外显子2~6a）。在外显子2(a-337g, c37t, c64g)和外显子6a(g761a)鉴别出了新突变，编码a224t替代和delc776-g787，导致4个氨基酸h229–l232的缺失。在100名正常身高对照个体未见这些突变（除a-337g外）。通过以alui (在a-337g), hin6i (c37t), smai (c64g),和ddei (c674t)消化各自pcr产物，证实了这些突变，尽管在g761a突变的accii限制性酶切位点被破坏。所有女性病人的突变(a-337g, c37t, c674t, g761a)为不同的杂合性。在2名iss个体发现了以前所鉴别出的c674t (r195x)（表1）。根据父母的基因型-表型关系，发现sscp分析的750名病人中至少有3名（0.4%）为功能性基因内突变。我们根据病人与父母和正常身高受试者间的基因型-表型关系，确定了一种突变的功能性。6种突变中的4种位于基因的非编码区域，并不翻译蛋白。在正常身高个体也检测出了外显子6a的2种突变。因此，有充分的理由假设，6种突变的确为功能性多态性。
在研究过程中，看到lwd病人的shox突变范围有相当大的偏斜，大部分为基因完全缺失。为了确定以往在lwd病人报告的基因完全缺失是否也出现在矮身高病人，通过对中期染色体使用fish，分析150名病人的dna样本。在20%的儿童（150名中有3名）检测出完全的shox缺失。结果提示，iss病人的基因缺失普遍为功能性shox突变，出现频数为基因内突变的5倍以上。总之，本研究结果表明，iss病人的功能性突变为2.4%。
我们的以及其它实验室检测的lwd病人突变数据表现出了其它更加普遍的特征（表2）。完全shox缺失儿童的表型与点突变病人无差别，与基因的其它区域相比，同源框区域内的突变频数未显著增加。反而，突变似乎遍及全部基因。至今，尚未发现sh3结构域结合位点内和oar结构域编码区域的突变（图1）。导致蛋白截断的无义突变是基因内突变的主要类型，而且发现存在于约2/3的病人（表2）。c674t突变是最多的点突变，导致密码子r195x和蛋白链的终止，在4名iss和lwd病人发现了这种突变（图1和表2）。
讨论
shox基因属于转录调节因子家族，主要控制发育过程。shox的同源基因存在于鸡、鱼和其它脊椎动物，提示该基因对发育有重要作用。受孕后32天的人类胚胎，在发育中的四肢发现了shox基因表达的最早证据。
已经证明shox基因逃逸了x的失活，在有活性和无活性的x和y染色体表达等位基因。在过去的几年中，逐渐了解到shox单倍体不足导致矮身高显性表型和间或的其它骨骼异常，例如马德隆畸形。常见表现存在家庭内和家庭间的异质性，女性更常见疾病表型并更严重。因为单倍体不足综合征的基本作用是扰乱精确平衡的时空表达，所以表达水平的变化解释了shox突变显示的严重程度。在lwd综合征和iss表型可能出现相同的shox突变，也提示了shox表型复杂的遗传型和表型的异质性。修饰基因，外成遗传相互作用和随机效应可能解释了这些现象。
虽然在60~100%的lwd征兆的病人发现了shox突变，但我们的研究证实，2.4%的无明显骨畸形的矮身高病人也存在功能性shox突变。在2.4%之中，2.0%是基因完全缺失，0.4%是基因内突变。与其它已经确认的生长障碍病因相比，shox的发生率如何呢？2.4%的iss病人存在shox突变说明人群发生率至少为1/2000。相比之下，已经确认，在3500名儿童中有1例的典型gh缺乏，在2500名女孩中或5000名儿童中有1例的特纳综合征。因此，在iss儿童中，因shox基因缺失而矮身高的发生率与gh缺乏或特纳综合征相似。
在我们的检测分析中可能遗漏了一定比例的突变病例。对于sscp，估计检测突变的敏感性为80%。再者，并不都是转录定位存在缺陷。显然，iss和lwd病人shox突变范围高度偏斜，大部分表现为基因完全缺失。虽然染色体dna的大部缺失通常罕见，但是，拟常染色体区域中衔接或散在重复序列优势可容易地理解shox缺失的高发生率。
有趣的是，shox单倍体不足的骨异常发生率似乎随年龄而增加。例如，其中1名病人(j451)在7岁时没有骨异常表现，但在4年后的青春期中表现出边缘性的肘外翻和马德隆畸形。这种现象与性腺类固醇引起shox单倍体不足病人生长板过早融合不平衡而加重畸形的假设相一致。这种影响可能以女性优势和青春期速度影响的方式加重了骨骼的损害。
根据本研究数据和以往的研究报告可得出一个重要的结论，突变类型和基因内位置与结果表型之间无相关。同样，完全基因缺失或基因内无效突变的表型表现无差异。因此，与shox相关的矮身高分子学基础为，由于一个等位基因功能缺失，导致总活性减少50%（单倍体不足）所致。此外，纯合子shox突变导致兰格侏儒症（肢中性）的显著表型，而shox的过量表达，例如克兰费尔特综合征（klinefelter syndrome），引起或贡献于长四肢和高身高。
在过去的10年中，临床研究证明重组gh能够有效、安全的增加特纳综合征儿童的最终身高。特纳综合征的矮身高和其它有或无骨发育异常的shox缺陷病人的主要病因是shox基因单倍体不足。因为gh也能有效治疗iss和特纳综合征儿童，所以已经提出，gh治疗可能也改善有shox缺陷的非特纳综合征儿童的生长速度和最终身高的假设，一项正式的、有同期随机未治疗对照组的临床试验正在进行之中，以对这个假设进行严格的检验。